1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種: 白色念珠菌(Candida albicans ATCC10231)，購自中國醫學菌種保藏中心。

1.1.2 培(pei)養(yang)基(ji)(ji)(ji)與試(shi)劑: 沙堡(bao)葡(pu)萄糖(tang)瓊脂固體培(pei)養(yang)基(ji)(ji)(ji)(SDA)、RPM-1640液體培(pei)養(yang)基(ji)(ji)(ji)和(he)酵(jiao)母浸出粉(fen)胨葡(pu)萄糖(tang)培(pei)養(yang)基(ji)(ji)(ji)(YEPD)；蛋黃培(pei)養(yang)基(ji)(ji)(ji)；紫草素標準品購于成都曼斯特股份(fen)有限公司。

1.1.3 主要實(shi)驗儀(yi)(yi)器設(she)備: 酶標儀(yi)(yi)(Thermo MULTISKAN ASCENT)；PCR儀(yi)(yi)(英(ying)國(guo)TTECHNE-512型(xing))；實(shi)時熒光定量PCR儀(yi)(yi)(日本TAKARATP800)；電(dian)泳凝膠定量分(fen)析系統(tong)(Bio-Rad公司，Version 3.1)；掃描電(dian)鏡(jing)(KYKY-1000B)；激光共聚焦顯微鏡(jing)(Zeizz LSM 710，German)。

1.2 紫草素對白色念珠(zhu)菌(jun)的抑制作(zuo)用測定(ding)

將200 μL培養(yang)至對數期的(de)白色念珠菌(jun)的(de)菌(jun)懸液(ye)(106 CFU/mL)分(fen)別(bie)加(jia)(jia)入(ru)(ru)96孔板中，再加(jia)(jia)入(ru)(ru)20μL不同濃(nong)度(du)(du)的(de)紫(zi)草素藥液(ye)，使其(qi)(qi)終濃(nong)度(du)(du)分(fen)別(bie)為(wei)(wei)64、32、16、8、4μg/mL，37℃培養(yang)24h后于595 nm處測定吸光值(zhi)。以不加(jia)(jia)藥物組為(wei)(wei)空白對照。實驗重復(fu)3次，取平均值(zhi)。其(qi)(qi)中，紫(zi)草素對白色念珠菌(jun)的(de)最(zui)低抑菌(jun)濃(nong)度(du)(du)(MIC)值(zhi)為(wei)(wei)菌(jun)體的(de)OD值(zhi)下降80%以上的(de)最(zui)低藥物濃(nong)度(du)(du)。從(cong)大于MIC的(de)各孔中分(fen)別(bie)取10μL菌(jun)懸液(ye)涂布于SDA固(gu)體培養(yang)基上，37℃培養(yang)48h后觀察菌(jun)體生長情(qing)況，最(zui)低殺(sha)菌(jun)濃(nong)度(du)(du)(MFC)為(wei)(wei)平板上沒有菌(jun)體生長的(de)最(zui)低藥物濃(nong)度(du)(du)。

1.3 紫(zi)草素對白色(se)念珠菌細胞膜滲透(tou)性的影響

將(jiang)培養(yang)(yang)至對(dui)數(shu)期的菌(jun)懸液按2%接(jie)種量接(jie)種于(yu)20mL RPM-1640液體培養(yang)(yang)基中(zhong)，以(yi)150r/min、30℃恒(heng)溫培養(yang)(yang)16h后，離(li)心棄上(shang)清(qing)液，用PBS洗滌菌(jun)體2次，制成適當濃度(du)的白色念珠菌(jun)菌(jun)懸液，分(fen)別向(xiang)其中(zhong)加入濃度(du)為(wei)MIC和2MIC的紫(zi)(zi)草(cao)素(su)繼續培養(yang)(yang)12h，每(mei)隔2h分(fen)別取樣(yang)液4mL，4000r/min離(li)心10min棄沉淀(dian)，用紫(zi)(zi)外(wai)分(fen)光光度(du)計于(yu)260nm下測定上(shang)清(qing)液中(zhong)DNA和RNA等大(da)分(fen)子物質的變化。以(yi)不加藥為(wei)空(kong)白對(dui)照組，實驗重復3次，取平均值。

1.4 紫草素對白色念珠菌形態的影響

將培(pei)(pei)養至對數期的(de)(de)(de)(de)(de)白色念珠菌菌懸(xuan)液(ye)(107 CFU/mL)接種于含紫(zi)草(cao)素(su)終濃(nong)度(du)為MIC的(de)(de)(de)(de)(de)YEPD液(ye)體培(pei)(pei)養基中(zhong)，150r/min、30℃振蕩(dang)培(pei)(pei)養。于6h和16h分(fen)別(bie)取1mL菌懸(xuan)液(ye)，3000r/min離心5min后(hou)棄上清。再(zai)加入(ru)0.5mL PBS緩沖液(ye)和0.5mL 2.5%的(de)(de)(de)(de)(de)戊二醛，4℃冰(bing)箱固定過夜。次日用PBS緩沖液(ye)沖洗2次，50%、80%、100%乙醇(chun)(chun)依(yi)次脫水1次，每次15min，100%乙醇(chun)(chun)浸(jin)沒的(de)(de)(de)(de)(de)電(dian)(dian)鏡(jing)(jing)樣品置4℃冰(bing)箱中(zhong)降溫(wen)10min后(hou)，放入(ru)真(zhen)空(kong)干燥(zao)(zao)器中(zhong)干燥(zao)(zao)40min。待(dai)干燥(zao)(zao)后(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)樣品溫(wen)度(du)升至室溫(wen)后(hou)取出，噴金鍍膜，使(shi)用掃描(miao)電(dian)(dian)鏡(jing)(jing)觀察照相，以不加藥組為空(kong)白對照，實驗重復3次。

1.5 紫草(cao)素對白色念(nian)珠菌細胞內鈣離子濃度的影響

將2mL RPM-1640培養(yang)(yang)基及300μL培養(yang)(yang)至對數期的菌懸液(ye)(106CFU/mL)分別加(jia)入(ru)(ru)6孔(kong)(kong)(kong)(kong)板中(zhong)，每(mei)(mei)孔(kong)(kong)(kong)(kong)內分別放一(yi)片(pian)無菌蓋(gai)玻片(pian)，37℃培養(yang)(yang)4h后，以(yi)加(jia)入(ru)(ru)300μL濃(nong)度(du)(du)為(wei)MIC的紫草(cao)素的孔(kong)(kong)(kong)(kong)為(wei)實(shi)(shi)驗(yan)組，加(jia)入(ru)(ru)300μL去離子水的孔(kong)(kong)(kong)(kong)為(wei)空白對照(zhao)組，37℃下繼(ji)續培養(yang)(yang)16h。然(ran)后吸出每(mei)(mei)孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)的液(ye)體，用(yong)PBS緩沖液(ye)洗滌2次(ci)。陰干后于(yu)避光(guang)(guang)環境下向(xiang)每(mei)(mei)孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)加(jia)入(ru)(ru)1mL 5μmol/L的鈣離子熒(ying)(ying)光(guang)(guang)探針(Fluo-3AM)，于(yu)37℃培養(yang)(yang)箱(xiang)中(zhong)孵育45min進行(xing)探針裝(zhuang)載。吸出剩(sheng)余的熒(ying)(ying)光(guang)(guang)探針染液(ye)并用(yong)PBS緩沖液(ye)沖洗，置于(yu)37℃培養(yang)(yang)箱(xiang)中(zhong)繼(ji)續孵育15min，以(yi)確保(bao)Fluo-3AM完(wan)全轉變為(wei)Fluo-3。取出蓋(gai)玻片(pian)，用(yong)10μL抗熒(ying)(ying)光(guang)(guang)淬滅劑(ji)進行(xing)封(feng)片(pian)后，利用(yong)激光(guang)(guang)共聚焦(jiao)顯微鏡(jing)檢(jian)測(ce)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)強(qiang)度(du)(du)，并按照(zhao)公式(1)計算(suan)鈣離子濃(nong)度(du)(du)([Ca2+])變化百(bai)分率。實(shi)(shi)驗(yan)重復3次(ci)。

1.6 紫草素(su)對白色念珠菌(jun)分泌胞(bao)外磷脂(zhi)酶(mei)(phosphlipase，PL)的(de)影響

制備10μL含紫草(cao)素終濃度(du)為1/2MIC和(he)MIC的(de)菌(jun)(jun)(jun)懸液(106 CFU/mL)并用(yong)移液槍(qiang)接種(zhong)于卵(luan)黃培養基上(shang)，以(yi)加等(deng)量PBS的(de)菌(jun)(jun)(jun)懸液為空白(bai)對照(zhao)，于37℃下培養48h。待(dai)培養結束后(hou)，用(yong)刻度(du)尺分別測量平板(ban)上(shang)的(de)菌(jun)(jun)(jun)落(luo)(luo)直(zhi)(zhi)(zhi)徑(jing)和(he)沉淀圈直(zhi)(zhi)(zhi)徑(jing)，每組(zu)實驗重(zhong)復(fu)3次，取平均值(zhi)(zhi)。磷脂(zhi)(zhi)酶(mei)的(de)活(huo)(huo)性(xing)用(yong)PZ值(zhi)(zhi)表示，PZ值(zhi)(zhi)按(an)下列公(gong)式計算。PZ值(zhi)(zhi)=菌(jun)(jun)(jun)落(luo)(luo)直(zhi)(zhi)(zhi)徑(jing)/總直(zhi)(zhi)(zhi)徑(jing)。總直(zhi)(zhi)(zhi)徑(jing)=菌(jun)(jun)(jun)落(luo)(luo)直(zhi)(zhi)(zhi)徑(jing)+菌(jun)(jun)(jun)落(luo)(luo)周圍沉淀圈的(de)直(zhi)(zhi)(zhi)徑(jing)。PZ=1，表示無磷脂(zhi)(zhi)酶(mei)活(huo)(huo)性(xing)；PZ值(zhi)(zhi)<1，表示有磷脂(zhi)(zhi)酶(mei)活(huo)(huo)性(xing)，且PZ值(zhi)(zhi)越大，磷脂(zhi)(zhi)酶(mei)的(de)活(huo)(huo)性(xing)越弱。

1.7 紫草素對白色(se)念(nian)珠(zhu)菌PLB1和PLB2相(xiang)對表達量的影(ying)響

1.7.1 白色(se)念(nian)珠菌PLB1和PLB2基因(yin)的(de)(de)(de)檢測: 提取模(mo)板(ban)DNA，根據GenBank中已發布的(de)(de)(de)白色(se)念(nian)珠菌的(de)(de)(de)基因(yin)序列，利(li)用Primer 5.0軟件及參考(kao)文(wen)獻設(she)計(ji)磷(lin)脂酶(mei)相關(guan)基因(yin)PLB1和PLB2的(de)(de)(de)上下游(you)引物，瓊脂糖凝膠電(dian)泳檢測PCR擴(kuo)增產物。PCR擴(kuo)增條件為(wei)94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，30個循環；72℃ 10min。

1.7.2 紫草素對白色念珠(zhu)菌PLB1和PLB2相(xiang)對表達(da)量的影響: 將培養至對數期的菌懸(xuan)液(ye)接種到含紫草素終(zhong)濃度分別為(wei)1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC的RPM-1640培養基(ji)中(zhong)，30℃、150 r/min培養16h后(hou)，采用Trizol法(fa)提取(qu)RNA，用微量核(he)酸測(ce)量儀進行RNA濃度的定量。采用2步法(fa)反轉合成模板cDNA，根據設計合成RT-PCR引物(wu)進行擴增。以(yi)18SrRNA為(wei)內參基(ji)因，以(yi)不加藥物(wu)組為(wei)空白對照。待反應結束后(hou)分析RT-PCR的擴增曲線和融解(jie)曲線，并計算PLB1和PLB2基(ji)因的相(xiang)對表達(da)量。

1.8 統計學方法

采用SPSS 17.0及Curve Expert 1.3統(tong)計軟件進(jin)行分析(xi)，數值用均數±標準差(x±s)表示。予以(yi)卡方檢驗(yan)和t檢驗(yan)。以(yi)P<0.05為具有統(tong)計學(xue)意義。

2 結果和分析

2.1 紫草素(su)對(dui)白色念珠菌的抑制(zhi)作用

實驗結果(guo)顯示，紫草(cao)素對(dui)白色(se)念(nian)珠菌有顯著的(de)抑(yi)制和殺(sha)滅(mie)作用，且(qie)呈濃度劑量(liang)依賴。其抑(yi)殺(sha)白色(se)念(nian)珠菌的(de)MIC和MFC分別為16 μg/mL和32 μg/mL。

2.2 紫草素(su)對白(bai)色(se)念珠菌細胞膜(mo)滲透(tou)性(xing)的影響(xiang)

實驗(yan)結(jie)果(guo)顯(xian)示(圖 1)，紫(zi)(zi)草素能導致細胞(bao)內DNA和(he)RNA等大(da)分子物質的(de)(de)(de)泄漏，其中(zhong)MIC的(de)(de)(de)紫(zi)(zi)草素作用菌體12 h后，上清液中(zhong)的(de)(de)(de)DNA和(he)RNA等大(da)分子含量與對照(zhao)組相比增加(jia)了117.32% (P < 0.01)，表明紫(zi)(zi)草素可破壞(huai)白(bai)色念珠菌細胞(bao)膜的(de)(de)(de)完整性，使細胞(bao)膜的(de)(de)(de)通透性大(da)大(da)增加(jia)。

2.3 紫草素對白色念珠菌(jun)細胞形態的影響

掃描電鏡結(jie)果顯示(shi)(圖 2)，MIC紫草(cao)素作用(yong)白(bai)色(se)念珠菌后(hou)，其(qi)細(xi)胞形態(tai)發生了(le)明顯的改變。其(qi)中對(dui)照組的白(bai)色(se)念珠菌(圖 2-A)，形態(tai)規則、外觀飽滿、表(biao)面(mian)光(guang)滑(hua)致密、折光(guang)性好。而加(jia)藥處理6 h后(hou)(圖 2-B)，細(xi)胞表(biao)面(mian)開始變得粗糙，扭曲(qu)變形。當藥物作用(yong)菌體16 h后(hou)(圖 2-C)，大(da)部分菌體嚴重皺(zhou)縮、干癟、扭曲(qu)變形，菌體表(biao)面(mian)凹凸(tu)不平，形成囊(nang)泡狀或(huo)不規則的突起結(jie)構。

2.4 紫草素對白色念珠菌鈣離(li)子通透性的影響

利用鈣離子(zi)熒(ying)光(guang)探(tan)針Fluo-3 AM檢測(ce)細胞(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)[Ca2+]變化的(de)(de)(de)原理，是Fluo-3 AM進入菌體(ti)細胞(bao)(bao)(bao)(bao)后，能(neng)在(zai)細胞(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)水(shui)(shui)解(jie)酶的(de)(de)(de)作用下水(shui)(shui)解(jie)成(cheng)Fluo-3，Fluo-3與(yu)細胞(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)鈣離子(zi)的(de)(de)(de)結合物能(neng)在(zai)激(ji)發光(guang)下產(chan)生(sheng)特異的(de)(de)(de)熒(ying)光(guang)。熒(ying)光(guang)強度可反映(ying)細胞(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)的(de)(de)(de)[Ca2+]，熒(ying)光(guang)強度越(yue)弱，表示(shi)細胞(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)[Ca2+]流失的(de)(de)(de)越(yue)多(duo)，細胞(bao)(bao)(bao)(bao)膜的(de)(de)(de)損(sun)傷越(yue)嚴重。激(ji)光(guang)共聚焦顯(xian)微鏡結果顯(xian)示(shi)(圖 3)，紫(zi)草(cao)素能(neng)顯(xian)著降低白色念珠菌細胞(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)的(de)(de)(de)[Ca2+]，與(yu)對照組相比，MIC的(de)(de)(de)紫(zi)草(cao)素能(neng)使(shi)白色念珠菌細胞(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)的(de)(de)(de)[Ca2+]降低72.02% (P < 0.01)。表明紫(zi)草(cao)素能(neng)夠破壞白色念珠菌細胞(bao)(bao)(bao)(bao)膜的(de)(de)(de)完整(zheng)性使(shi)細胞(bao)(bao)(bao)(bao)膜的(de)(de)(de)通(tong)透性大大增(zeng)加。

2.5 紫草素(su)對白色(se)念珠菌分泌的(de)胞外磷脂酶的(de)影響

采用卵黃培(pei)養基(ji)平板法檢測磷(lin)脂(zhi)(zhi)酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)原理，是菌體分泌到細胞外的(de)(de)磷(lin)脂(zhi)(zhi)酶(mei)(mei)(mei)能(neng)將培(pei)養基(ji)中(zhong)所含的(de)(de)磷(lin)脂(zhi)(zhi)分解成(cheng)(cheng)脂(zhi)(zhi)肪酸，脂(zhi)(zhi)肪酸與培(pei)養基(ji)中(zhong)的(de)(de)鈣反應能(neng)形成(cheng)(cheng)脂(zhi)(zhi)肪酸鈣沉淀圈。因此根據形成(cheng)(cheng)的(de)(de)沉淀圈的(de)(de)大小(xiao)，即可判斷菌體分泌磷(lin)脂(zhi)(zhi)酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)活性。本實驗結果顯示(表 3)，不同濃度的(de)(de)紫(zi)草素均可抑制(zhi)白色念珠菌分泌磷(lin)脂(zhi)(zhi)酶(mei)(mei)(mei)，且(qie)呈濃度劑量依(yi)賴。其中(zhong)，與對照(zhao)組相比，MIC的(de)(de)紫(zi)草素能(neng)使(shi)白色念珠菌分泌磷(lin)脂(zhi)(zhi)酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)量下降56.3% (P < 0.01)。

2.6 紫草(cao)素(su)對白色念珠(zhu)菌PLB1和PLB2基因相對表達量(liang)的影響

PCR結果顯示(shi)，白(bai)色(se)(se)念(nian)珠菌中存在編碼磷脂酶B的(de)相(xiang)關基因PLB1和(he)PLB2基因(圖 4)。RT-PCR結果顯示(shi)(圖 5)，紫草素可(ke)降低PLB1和(he)PLB2基因的(de)相(xiang)對(dui)(dui)表達量，且呈(cheng)濃度(du)劑量依(yi)賴(lai)。其中1/2MIC的(de)紫草素作用(yong)白(bai)色(se)(se)念(nian)珠菌16 h后，與(yu)對(dui)(dui)照組相(xiang)比，PLB1和(he)PLB2基因的(de)相(xiang)對(dui)(dui)表達量分別降低了56.4%和(he)61.4% (P < 0.01)。